对抗抗生素耐药性

在全球范围内,抗生素耐药性是对人类健康不断上升的重大威胁。目前迫切需要开发易用的、可以在床旁检测耐药性的敏感性试验,从而可以及时开出合适的抗生素处方,挽救患者生命 

然而,传统的抗生素耐药性检测方法均是基于细胞培养技术或聚合酶链反应 (PCR) 测定,其中两者都不适用于即时诊断。

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由 Hywel Morgan 教授带领的一个南安普敦大学团队现在开发出一种具有成本效益、高灵敏度和便携的数字微流体设备,可利用 RPA 和芯片荧光定量检测从患者样品中提取的 DNA 中的耐药基因。研究人员希望该平台能够形成易用的一次性设备的基础,让医院或社区医生可以常规使用,以在严重感染患者中确定多种抗生素耐药基因,从而尽快开始最佳治疗。

数字微流体平台使用的是薄膜晶体管 (TFT) 控制的介质上电润湿 (EWOD) 技术或有源矩阵介质上电润湿 (AM-EWOD) 技术。由南安普敦团队开发的 AM-EWOD 芯片包含 16,800 个单独的软件控制电极,可以二维操纵含有反应物、样品和对照物的纳升级液滴,以及确定液滴的大小和形状。该芯片还包括用于实时液滴定位和大小检测的内置阻抗传感器,用于温度感知的芯片热敏电阻,和用于将液滴温度保持在 RPA 反应的最佳温度 39°C 的集成加热器。

研究人员利用其原型 AM-EWOD 设备扩增和检测从大肠杆菌提取的 DNA 中的广谱 β-内酰胺酶耐药基因 blaCTX-M-15。使用芯片时,首先通过移液管将 DNA 液滴、RPA 反应混合物、醋酸镁和对照液滴装入储存器电极,然后将这些液滴或子液滴的等分试样从软件控制下的储存器转移到芯片上的预定位置,并使用程序化的混合顺序进行混合,以便 RPA 反应可以继续进行。扩增后,另一个软件控制顺序将液滴转移到芯片上的荧光检测位置。

反应液滴不断地来回穿梭,以加快混合和 RPA 反应速度。Morgan 教授说,这种连续混合可以将目标 DNA 检测速度提高为台式 RPA 测定法的 100 倍。“该芯片能够在约 15 分钟内检测单个 blaCTX-M-15 基因拷贝。”使用纳升级液滴也意味着其所需试剂比常规台式测定法所需的试剂少约 50 倍。

Morgan 教授的团队在一篇题为“Rapid and sensitive detection of antibiotic resistance on a programmable digital microfluidic platform”(可编程数字微流控平台上抗生素耐药性的快速灵敏检测)1a的论文中介绍了芯片实验室的技术。“自论文发表以来,我们在同一芯片上进行了多重测定,以检测三种不同的细菌耐药基因。”Morgan 教授说,“可以使用单个芯片来识别导致感染的微生物,并确定该微生物是否对某些抗生素有耐药性。”

在随后的工作中,该团队开发了一种将半导体 TFT 纳米带传感器与 RPA 结合在一起的芯片器件,以提供基于 pH 的电子读出系统。他们表示这种检测方法比使用 exo-探针来定量扩增的目标 DNA2 的常规荧光检测更快速、更灵敏。在检测中,pH 传感器技术能够在 15 分钟内从大肠杆菌肺炎克雷伯菌临床分离株提取的基因组 DNA 中检测少于 10 个拷贝的抗生素耐药基因,对于有 100 个拷贝的基因,能够在 3 分钟内获得阳性结果。Morgan 教授说,晶体管易于制造且成本低廉,并且可以轻易地整合到数字微流体系统中。他们在Biosensors and Bioelectronics上发表了一篇题为“Ultra-fast electronic detection of antimicrobial resistance genes using isothermal amplification and Thin Film Transistor sensors”(使用等温扩增和薄膜晶体管传感器的抗微生物耐药基因的超快速电子检测)的论文,报告了pH 传感器技术。

 

1Lab on a Chip 2015. Jul 21;15(14):3065-75. doi: 10.1039/c5lc00462d
2 Biosensors and Bioelectronics 2017. Volume 96, 15 October 2017, Pages 281–287. doi: 10.1016/j.bios.2017.05.016
a This report is independent research funded by the National Institute for Health Research (Invention for Innovation (i4i) Programme grant II-ES-0511-21002). The views expressed in this publication are those of the author(s) and not necessarily those of the NHS, National Institute for Health Research or Department of Health.