水卫生

德国研究人员已利用 RPA 开发出一种自动 DNA 扩增和化学发光微阵列平台,该平台可以同时识别并定量水中的多种病毒和细菌污染物1

这一多重技术是对一种名为 MCR 3(第三代微阵列芯片读取器)的导流装置的改造,由 Michael Seidel 博士在慕尼黑工业大学 (TUM) 水化学研究所(负责教授:Niessner 博士)2研发。研究团队最初设计了基于流的 MCR 3 系统,用于食品和水安全检测中的自动免疫分析工作。RPA(用于恒温 DNA 扩增)与 HRP 标记链霉亲和素(用于在同一芯片上进行化学发光检测)的潜在结合,为便携式实地水检测系统的开发带来了诸多机会。

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研究团队重建了装置的芯片加载单元,纳入了一个可控的热电加热模块,并加入了一个杂交盒3。Seidel 博士指出:“37-40°C 的 RPA 工作温度对于导流微阵列而言十分理想。正是 RPA 的这一关键特征,使我们能够在芯片上实现扩增。其他恒温扩增技术需要的温度更高,这可能会使芯片上的水蒸发,从而破坏实验或损坏微阵列。RPA 是我们所知的最有望直接在 DNA 微阵列上操作的方法。”

TUM 团队开发出的方法包含固相和液相扩增。空间上分离的、未标记的各病原体特异性反向引物点直接显现到芯片表面上。生物素标记的正向引物、未标记的反向引物和 RPA 试剂被添加到微阵列表面上方的液相中。生物素化的扩增产物会在反应期间直接在芯片上合成产生,也会形成体相,并杂交成固相化引物。团队称,这一双重扩增循环提高了分析的灵敏度。试剂流是单向的,所需的射流元件最少 — 理论上只要一个阀门和一个注射泵即可。HRP 链霉亲和素与生物素标记结合,使化学发光检测成为可能。

对平台进行测试时,研究团队首先开展试验检测单一微生物,然后再检测同一芯片上的多种微生物,具体方法为对以下每种病菌或病菌组合添加带有 DNA 模板的水样本。这些病菌有:水生细菌性和病毒性病原体、41 型人腺病毒 (HAdV 41)、粪肠球菌以及大肠杆菌噬菌体 Phi X 174。研究人员也成功使用了来自培养提取物的基因组 DNA。HAdV 41、Phi X 174 和粪肠球菌的检出限 (LOD) 分别为 35 个基因组单位 (GU)/μL、1 GU/μL 和 5 x 103 GU/μL。据作者介绍,这与 qPCR 分析报告的灵敏度相当,但分析时间大大缩短。

研究人员在其发表的论文 Analytical Chemistry(《分析化学》)中总结道:“由于扩增是针对每个点上的一种靶标病原体单独进行,因此可以将开发的检测方法改良为多重检测方法。病原体通过其在微阵列中的点位识别,而化学发光强度则与样本中的病原体 DNA 数量相关联。”

自论文发表以来,TUM 研究人员已将其平台打造成一个便携式微阵列,用于检测从冷却塔或空调系统中提取的浓缩水样本中的军团菌。目前平台正处于验证测试阶段。Seidel 博士强调:“我们的目的是让这一技术不需要太多培训就能够为人们所用。整个过程自动进行,并且十分简单。未来我们希望开发出一个应用广泛的水卫生监测平台,能同时检测工业水和饮用水浓缩样本中的 10 到 15 种不同的细菌和病毒污染物。”

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1 Kunze, A.; Dilcher, M.; Abd El Wahed, A.; Hufert, F.; Niessner, R. and Seidel, M., On-Chip Isothermal Nucleic Acid Amplification on Flow-Based Chemiluminescence Microarray Analysis Platform for the Detection of Viruses and Bacteria. Analytical Chemistry 2016, 88, 898–905. DOI:10.1021/acs.analchem.5b03540.
2 
Seidel, M. and Niessner, R., Chemiluminescence microarrays: a critical review. Analytical and Bioanalytical Chemistry 2014,406, 5589–5612, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25002333
3 Lengger, S.; Otto, J.; Elsaesser, D.; Schneider, O.; Tiehm, A.; Fleischer, J.; Niessner, R.; Seidel, M., Oligonucleotide microarray chip for the quantification of MS2, PhiX174, and adenoviruses on the multiplex analysis platform MCR 3. Analytical Bioanalytical Chemistry 2014, 406, 3323-3334, link.springer.com/article/10.1007%2Fs00216-014-7641-y