生物防护

西班牙研究人员正以 RPA 为基础研究一种高度灵敏且具有特异诊断能力的固相光学分析法,该分析法可以在 1 小时之内检测出潜在的生物战剂 — 鼠疫杆菌1

罗维拉·威尔吉利大学 Interfibio 研究组和 ICREA(加泰罗尼亚高等研究院的)的 Ioanis Katakis 和 Ciara K. O’Sullivan 研发的酶联寡核苷酸检测 (ELONA) 法使用常规 PCR 引物扩增单链和双链 鼠疫杆菌 DNA。他们的研究证实了将一个引物固定在固相表面而以反相形式应用 RPA 的这一设想。研究人员的目的是进一步将该技术发展成为可携带的集成式横向流动测试设备,用于在资源有限的环境及实地环境中进行鼠疫杆菌的快速扩增和检测。

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鼠疫杆菌引起黑死病和肺炎性鼠疫,且高达 60% 的病例没有得到及时治疗而死亡。该微生物被美国疾病控制与预防中心认为是一种潜在的生物战剂。虽然鼠疫杆菌的及时诊断有助于快速开始治疗,但当前的瘟疫检测金标准非常耗时,并需要细菌分离。

Ioanis Katakis 及其同事报告的定量检测方法利用 RPA 在 30 分钟内完成了鼠疫杆菌 DNA 扩增,并在一小时内完成了目视检测。该反相检测方法需要将硫醇化正向引物固定在马来酰亚胺活化的微孔板上。固相 RPA 反应在 37°C 的含有液相生物素化下游引物和单链或双链 DNA 模板的孔内进行。使用链霉亲和素-HRP 标记的探针来检测经扩增的靶标。

研究者首先通过使用传统 PCR 扩增鼠疫杆菌的合成 DNA 和基因组 DNA 来测试他们的引物。然后,他们将相同的引物应用到液相 RPA 技术,以再次扩增合成模板和基因组模板。接着将这些 PCR 引物应用到反相 RPA 方法,其中先在开发阶段采用合成模板,再使用从样本中提取的基因组 DNA 来验证设想。阴性对照方法包括不在 RPA 混合液中加入模板 DNA,或者使用非特异性 DNA 序列或非特异性正向引物。

结果表明固相 RPA 方法的灵敏度及特异性与 PCR 相当。Katakis 博士说道:“能够使用传统的 PCR 引物而无需设计更长、更昂贵的引物,这确实是一大好处。更短的引物相当于更简单的检测方法开发。事实上,我们在我们参与的其他分子诊断项目(包括 HLA 分型)中发现,使用短 PCR 引物进行 RPA 也非常有效。”

Katakis 和 O’Sullivan 博士打算将反相 RPA 方法整合到简单的横向流动设备中,用于检测鼠疫杆菌。Katakis 博士说道:“无论与 PCR 检测法相比还是与液相 RPA 相比,此技术都具有许多优势。RPA 不仅恒温(这意味着我们无需使用智能系统来循环变温),还适用较低的恒温值。此外,反相 RPA 方法相比液相方法需要更少的洗涤步骤,且只需要使用两个引物,而其他恒温扩增方法则需要四个引物和更复杂的试剂操作。技术越不复杂,出错的几率就越低。故障排除变得更简单,最终使得上市时间更快。在我看来,RPA 不只是个人偏好,在技术上它还是最适合使用的扩增方法。”

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1. O’Sullivan C. K., Katakis I. et al. Anal Bioanal Chem (2016) 408:671–676. DOI 10.1007/s00216-015-9177-1