重组酶聚合酶扩增 - PCR 的突破性恒温替代方法

TwistDx 的专利技术重组酶聚合酶扩增 (RPA) 彻底改变了我们在实验室和资源有限的现场环境中扩增和检测核酸的能力。

TwistDx 开发的核酸恒温扩增技术称为重组酶聚合酶扩增 (RPA) 技术,实现了便携式的快速核酸检测,是可以替代聚合酶链反应 (PCR) 技术的高度多用型技术。RPA 应用范围广泛,包括传染病诊断和食品污染测试等,极其适用于现场检测、医院的床边诊断和其他可以资源极少的应用,特别是亟需快速得出结果的情况。RPA 易于运输、使用简单并且高度灵敏,其特异诊断能力可与 PCR 扩增媲美,但速度快得多,通常可在 3-10 分钟内生成结果。与 PCR 不同,RPA 反应不需要热溶解或化学溶解,因此不需要昂贵的热循环仪或任何其他设备或试剂。

RPA 对操作温度的要求特别宽松。该反应在 37-42˚C 左右的温度下最有效,该温度范围低于其他恒温方法,但在更大的室温范围下也将有效。呈冻干形态时,RPA 试剂在室温下具有通常至少长达 12 个月的高度稳定性*。短期运输无需冷藏。而且,冻干试剂微球的工作流程简单,无需专业培训。

RPA 在很多应用中可替代 PCR。最终用户可轻易地使用其自己的引物设计出自己的超灵敏检测方法。可对 RPA 技术进行调整,使其适合各种微流体、横向流动和其他装置,且通过将逆转录酶加入反应混合液,RPA 技术还可用于扩增和检测 RNA。

我们的客户告诉我们该技术非常有效。

RPA 的工作原理

RPA 反应利用被称为重组酶的酶,这些酶与寡核苷酸引物形成复合体,并使引物与双链 DNA 中的同源序列配对。单链 DNA 结合 (SSB) 蛋白与被取代的 DNA 链结合,并使形成的 D 环保持稳定。然后从引物启动由聚合酶介导的 DNA 扩增,但前提是存在靶标序列。一旦启动,扩增反应将快速进行,因此开始时只需一点靶标 DNA 拷贝数,高特异性 DNA 扩增在数分钟内即可达到可检出水平。



 1RPA 循环


为什么选择重组酶聚合酶扩增?

速度
RPA 非常快速,在 37-42°C 这一通常最适宜的反应温度下,只需少量核酸分子即可在 3-10 分钟(通常)内扩增至可检出水平,但这将取决于靶标大小。在大部分情况下,只需要一个人即可在半小时内采集样本、制备样本、运行检测并取得结果,并且无需专业培训。相比之下,现行的惯例是临床样本必须送往中心实验室进行处理,且周转时间为 24 小时。

灵敏度
RPA 可检测复合样本中的单拷贝 DNA 和十拷贝或更少 RNA,而无需预先纯化核酸。

特异性
RPA 具有高度特异性,该技术可从可能含有数百纳克来自多个不同物种的不相关复合基因组 DNA(包括人 DNA)的样本中检测并扩增单个 DNA 分子。

低温运行
RPA 在恒定的低温(37-42°C 最适宜)下运行,无需在起始时溶解样本 DNA。对于某些应用,如果需要,即便体温也可支持 RPA 扩增。该反应在偏离温度及低温设置下也表现稳健,即使在常规室温 25°C 下也将奏效,虽然反应速度会下降;在此温度下,只要此生物化学过程被正确配置,仍可在一小时内获得结果。

样本容差
RPA 对样本类型的要求特别宽松,有时可直接检测未经核酸纯化的复合样本,例如血液、鼻拭子或培养基。通常,只需采用基本的病原体裂解方法处理样本以释放核酸即可,例如热处理或弱碱处理。每种检测所需的最合适的样本制备方法取决于病原体滴定度、是否存在抑制剂以及裂解要求等因素,并将需要设计到检测程序中。RPA 对某些复合样本类型的稳健性使该技术在原则上可能非常适合广泛的现场和床边应用。

广泛的适用性
RPA 能够方便地应用于任何 DNA 或 RNA 靶标。有最终用户报告称,通过将逆转录酶添加到反应混合液中开发出了超高灵敏度的 RNA 一锅检测法。

多重
通过将多种引物同时添加到同一反应管中,单次 RPA 测试即可扩增和检测多种不同的靶标。

低成本
RPA 仅需要基本的检测设备,也就是说,最终用户可以使用我们的产品开发出适合各种应用和环境的人性化诊断方法和试剂盒。

灵活的试剂形态
核心反应组分能够以稳定的干燥形态供货,该形态易于运输,且无需冷藏即可储存最多 12 个月(稳定性可能因用途不同而有变化,因此仍建议在冷藏条件下长期储存);也能够以 PCR 试剂更常见的液体形态供货,该形态允许用户针对特定的应用改变反应体积和组分比例。

多种检测形式
RPA 可应用于各种检测系统和仪器,包括实时荧光探针和夹心法等形式。

*对 PF exo 试剂盒进行内部测试