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检测:多种选择

by 4月 20, 2018

Olaf Piepenburg 

2018 4 20

TwistDx CSO,Olaf Piepenburg 博士

许多 RPA 用户希望能够检测出 DNA 扩增的发生,并全程监测反应。在我们最初开发该技术时,我们需要研究出 RPA 特定的方法来满足该需求。在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上分离反应产物是最常用的 PCR 后检测方法,但这种方法不可能实现高通量检测或床旁检测应用,并且有悖于我们简化分子诊断技术设备和方案的这一目标。

快速浏览一下我们的网站可以发现许多名为 exo、fpg 和 nfo 的产品,这些产品涉及以下三种主要检测方法,我们将在本篇博文中讨论这些方法:用核酸外切酶 III (exo) 或甲酰胺嘧啶糖基化酶 (fpg) 生成荧光信号,以及用核酸内切酶 IV (nfo) 进行横向流动夹心法检测。

将扩增事件转换成荧光信号显然是个不错的选择。我们不能直接取用 PCR 用的 TaqMan 探针,因为该探针需经 Taq 聚合酶裂解才释放荧光报告基团,而 RPA 聚合酶只具有链置换活性。因此,我们开发了另一种探针结构,其带有一对匹配的荧光团和淬灭团标记,两者之间是一个脱碱基位点(细胞 DNA 损伤的典型产物),该位点可被核酸外切酶 III 识别。探针因此被酶切,从而释放荧光团/淬灭团并增强荧光,这可以被任何现有方法检测到。也可以使用其他酶,例如 fpg,对探针结构稍作修改即可。

但不是每个人都想检测荧光,因此第二种酶系统使用 nfo 来酶解探针(不释放报告基团标记),使探针从本质上变为引物。探针含有抗原标记,例如生物素、地高辛或羧基荧光素,这些标记被掺入扩增后的遗传物质,可通过夹心检测法在横向流动试纸条上被检出;出现一条明显的线表明存在被标记的扩增子。

目前有超过 300 篇关于 RPA 的文献资料,其中介绍了许多其他检测模式,包括电化学检测法1 以及 fpg 探针联合横向流动检测法2。可以从不同方向进行检测,具体要看是能够随扩增切割探针,还是能够通过扩增事件将标记掺入 DNA。如果您对检测方法有任何疑问,或者需要一些建议,请随时与我们的客户服务团队联系 (techsupport@twistdx.co.uk).

1 Tsaloglou, M et al. Handheld isothermal amplification and electrochemical detection of DNA in resource-limited settings, Analytical Biochemistry, 543, 2018,116-121
http://gmwgroup.harvard.edu/pubs/pdf/1294.pdf

2 Powell, M et al. New fpg probe chemistry for direct detection of recombinase polymerase amplification on lateral flow strips, Analytical Biochemistry, 543, 2018, 108-115
https://doi.org/10.1016/j.ab.2017.12.003