Harvard-Led Team Develops Handheld Device for DNA Detection

15 一月 2018

2018 年 1 月 10 日 | John Gilmore

 纽约 (GenomeWeb) – 哈佛大学和非营利性机构 Diagnostics for All 的研究人员已将电化学检测与重组酶聚合酶扩增 (RPA) 整合到便携设备上,用于改善多种结核菌株的遗传物质检测效果。

 该研究在上个月发表于《分析生物化学》,研究团队的研究目的是简化遗传物质的床旁扩增和电化学检测,研究结果表明将 RPA 恒温分析与电化学读数相结合可以准确、快速地检测基因。本研究的部分资金由盖茨基金会和美国国防部国防威胁降低局提供。

RPA 是一种可以替代 PCR 的 DNA/RNA 扩增技术,最初由 TwistDx 开发,该公司现已被 Alere 收购,并将很快被 Abbott 收购。该技术因不需要相对昂贵的热循环仪,所以在资源有限的环境中成为首选技术。

RPA 反应利用被称为重组酶的酶,这些酶与寡核苷酸引物形成复合体,并使引物与 DNA 中的同源序列配对。单链 DNA 结合蛋白与被取代的 DNA 链结合,使形成的环保持稳定。之后引物在聚合酶的作用下启动 DNA 扩增,但前提是存在靶标 DNA 序列。

根据该研究可知,该团队的平台采用一次性试纸条,试纸条上集成有三个丝网印刷碳电极,能够以 +/-0.1 ºC 的准确度调节温度。2014 年发表于《美国科学院院报》的一篇论文介绍了通用移动型电化学检测器 (uMEDNA),该设备能够使用各种脉冲序列对扩增后的 DNA 进行电化学检测,该设备易于使用,只需稍加培训和督导即可。上述试纸条可以与 UMEDNA 或电化学分析仪配合使用,台式或便携式均可。

Maria-Nefeli Tsaloglou,在 Marie Curie Actions 资助下在哈佛大学从事博士后研究工作,也是此最新研究的资深作者,她表示研究人员自 2010 年起一直在开发基础诊断设备。她的团队致力于将试纸条(电化学检测技术)和执行 RPA 分析的专有 uMEDNA 设备商业化。该设备与智能手机大小相当,它通过自带的组件和算法来同时控制 DNA 扩增和执行电化学检测。

为检测 DNA,该团队首先制备试纸条,该试纸条除了要含有血样和引物,还集成含有 RPA 试剂的电极。使用试纸条可以减少反应体积,降低试剂成本并减少血液样本体积。在确定结核分枝杆菌和耻垢分枝杆菌共有的一个 213-bp 区域后,研究团队为 RPA 分析设计了合适的引物,用于扩增该特定序列。

该分析在 65 ºC 下进行,它将恒温扩增技术和氧化还原活性六氨合钌 (III) (Ru(NH3)6]3+) 的电化学读数技术相结合,后者作为 DNA 电化学检测的电活性介质。

为验证该分析方法的灵敏度,Tsaloglou 及其同事还使用起始浓度不同的耻垢分枝杆菌靶 DNA 进行了反应。根据该研究可知,该项分析的检测限值为 0.04 纳克/微升,相当于 11 CFU/ml 的结核分枝杆菌。

由于 RPA 分析不需要额外的样本制备时间,研究中的该分析需要 20 分钟即可鉴别生物信号。Tsaloglou 强调,RPA 检测有可能以更快的速度识别信号,具体取决于引物和靶序列的类型。

将 uMEDNA 设备插入手机的耳机插口即可传输该设备收集的数据。Tsaloglou 解释道,uMEDNA 设备还可与任何具有蓝牙功能的设备通信,并可与任何计算机、平板电脑或智能手机相连。目前,研究人员已开发出可在 Apple 设备上运行的软件,并正在修改该程序以使之适合在 Android 设备上运行。

虽然研究团队使用耻垢分枝杆菌作为结核分枝杆菌的替代菌株,但 Tsaloglou 及其同事开发的台式 RPA 分析设备可检测多达 19 种分枝杆菌。此外,该团队还使用掺有结核分枝杆菌 DNA 的样本进行实验,结果显示此电化学方法同样适用于该特定的菌株。

就使用一次性试纸条在便携式检测器上进行电化学核酸检测的这一技术,哈佛大学的研究人员已经与 Diagnostics for All 共同申请了一项共有专利。哈佛大学化学教授 George Whitesides,即这项新研究的通讯作者,于 2014 年成立了总部设在马萨诸塞州塞勒姆的 Diagnostics for All,该机构专注于发展中国家的医疗保健和诊断。该专利是关于 RPA 或其他恒温方法的电化学检测。

该非营利组织与哈佛实验室共同合作探索基于试纸的 uMEDNA 设备的低成本应用。

在商业化方面,Tsaloglou 表示该实验室正在研究阅读器样机,目前处于 alpha 测试阶段。Tsaloglou 的团队与电子行业内的专家(未公开身份)合作对设备进行 beta 测试以及商业推广,同时寻求其他合作伙伴。她预计在一年内可投入研究使用,到 2020 年可投入商业使用,但前提是团队能够找到其他必要的合作伙伴,并按计划使平台获得监管机构的批准。

通过遗传生物标志物检测病原体是一种公认方法,多家公司均采用此方法,其中 Cepheid 是使用该方法进行结核检测的最著名代表之一。Cepheid 的 GeneXpert MTB/RIFassay 在用于诊断活动性结核病方面受到了世界卫生组织的认可,并在检测利福平敏感性和耐药性方面表现卓越。

但是研究人员指出,GeneExpert 仅限于实验室使用,并且对于发展中国家和床旁检测的大多数应用而言过于昂贵。

Tsaloglou 表示 uMEDNA 设备对最终用户的定价只有大约 $30 美元。引入 DNA 检测试纸条也会使分析价格保持在一个相对较低的水平。

“实验室里的电化学分析仪体积庞大且价格昂贵,基本上在 $30 万到 $100 万美元之间,”她说。“在论文中我们证明了分析仪的尺寸可以更小,电子元件可以更便宜。”

Tsaloglou 认为,RPA 分析方法由于其恒温性质,可在资源有限的环境中大派用场。Tsaloglou 表示,在发展中国家使用经济实惠的便携式设备运行此分析可以准确检测结核病,几乎不会有灵敏度或准确性问题。她指出,该设备还可用于在乡村诊所、国家边境或港口鉴别各种传染性疾病,最终还可能用于居家保健监测。